Paso 1: procedimiento:
1. las células de la semilla:
Cosechar las células de MDCK-G del frasco. Aquí me salto el procedimiento de cosecha ya que es un procedimiento bastante estándar en todo laboratorio de biología. La célula de la semilla en Millicell insertos de cultivo celular de 24 pozos (Millipore PIRP12L04). Células MDCK-G, puse K 75 células/200uL en cada insert y 900ul de medio de cultivo en cada alimentador inferior bien. Este tiene membrana porosa de 1um PET (que significa que hay un montón de pequeños agujeros en la membrana). Las células pueden obtener nutrición de ambos lados.
2. transfección:
24 horas después de la siembra, las células de MDCK-G cubre la membrana entera y forma una capa monomolecular.
Diluir el gWiz-GFP utilizando OPTI-MEM (Gibco 31985-070). La concentración de GFP que utilizo es 20ug/mL. Retire el medio de cultivo fuera de la estufa y añadir 150uL de GFP diluido dentro de la inserción. El iPorator puede transfectar cuatro insertos de 24 pocillos (o dos 6-bien insrts) a la vez. Para preparar cuatro insertos con GFP.
iPorator requiere electrodos especiales durante la transfección (Primax Bioscience, E24A1108). Llenar la cámara del electrodo inferior con 1mL de Opti-MEM. Transferir los insertos con GFP en cámara de electrodo inferior y colocamos en el electrodo superior.
Siguiente paso, poner el electrodo conjunto con insertos en el iPorator.
Haga clic en "Transfección" en la interfaz de usuario.
El programa tiene un construir-en MDCK-G DNA transfección protocolo, así que solo seleccione protocolo y haga clic en "Inicio". Se tarda unos 4 minutos para terminar la transfección.
Después de la transfección, tomar el electrodo de la máquina y la transferencia de que los insertos de vuelta a la placa original del alimentador. Los insertos de dejar en temperatura ambiente durante unos 10 minutos con GFP y sustituir la GFP con medio de cultivo fresco 200ul. Poner los rellenos a incubadora de cultivo celular para 24 horas para que el expreso GFP. Para gWiz-GFP, se puede ver alguna expresión 2 horas después de la transfección, pero deberás esperar al menos durante la noche que expresa completamente.
