Paso 2: El protocolo
Este papel tiene una buena descripción de los diferentes métodos de descelularización de tejido:
Una visión general de procesos de descelularización de todo órgano y tejido
Realmente tenemos dos variantes del Protocolo de corazón de cerdo: el originalmente publicado por Wainwright et en su papel de 2010y el protocolo modificado del 2012 video en los diario de experimentos visualizados, por el mismo grupo. Ambas versiones comienzan con congelación en-80C y luego descongelar el corazón, para ayudar a romper las células.
Papel de Wainwright et al:
- Perfusión 3L 1 tipo reactivo grado de agua durante 15 min a 1 L/min, entonces 2xPBS (tamponada fosfato salino) durante 15 min a 1 L/min
- Perfusión 0.02% tripsina / ácido etilendiaminotetracético de 0.05% / 0,05% NaN3 a 37 ° C por 2h a 1 L/min
- Perfusión 1 de tipo agua durante 5 minutos, luego 2xPBS durante 15min
- Perfusión 3% Tritón X-100 / ácido etilendiaminotetracético de 0.05% / 0,05% NaN3 por 2 h a 1.3 L/min.
- Perfusión 1 de tipo agua durante 5 minutos, luego 2xPBS durante 15min
- Perfusión 4% solución de Ácido desoxicólico por 2h a 1.3 L/min.
- Perfusión 1 de tipo agua durante 5 minutos, luego 2xPBS durante 15min
- Perfusión de 0,1% de ácido peracético / etanol 4% durante 1h a 1,7 L/min
- Perfusión con PBS dos veces, y tipo 1 de agua tres veces, 15min en 1,7 L/min
Si se agrega todo junto, este protocolo toma cerca de 10 horas desde el inicio hasta el final de todos los pasos de la perfusión. La versión modificada del video de Zeus mucho pasa lo mismo, alargar el tratamiento con tripsina y desoxicólico ácido 3 h y el tratamiento detergente a 2.5 h, para un tiempo total de la perfusión alrededor de 13 horas! Ellos también rampa la velocidad de perfusión de 400ml/min para la perfusión de agua inicial, a 2.2 L/min para el desoxicólico y realizar los siguientes pasos.
En nuestro caso, sólo teníamos unos 10 del horas total para lograr esto, y la herida gastando una buena cantidad de ese tiempo probando la bomba, arreglando fugas en las conexiones, disecar hacia abajo el corazón etc.. Así que nos hiere para arriba ajustando la duración en el tiempo restante.
Por otra parte, ya que nosotros estábamos haciendo una obra maestra, en lugar de un corazón de fantasma que podría ser resembrado con éxito con células madre, sabíamos que podríamos engañar fácilmente a algunos de los ingredientes. En particular, utilizamos agua del grifo normal en vez de galones y galones de agua de grado de reactivo "Tipo 1" caro. Además, sólo usamos sal de cocina normal en agua del grifo en vez de tampón fosfato salino. Utiliza OxyClean (Percarbonato de sodio) en lugar de ácido peracético y 151-prueba Everclear en lugar de etanol de grado reactivo para el paso de desinfección final. También queríamos usar SDS en lugar de Triton X-100 como el detergente, ya que SDS tiende a blanquear el tejido mejor (a costa de ser somewha más severa en la matriz extracelular). No tenemos suficiente SDS, por lo que terminó yendo con SDS 2% / 1% Tritón X-100. También dejamos fuera la azida sódica (NaN3), que existe para inhibir el crecimiento bacteriano, pero también es muy tóxico - algo que sería más bien no meterse con en un entorno de DIY.
Oh y no tenemos acceso a una bomba peristáltica de alto volumen, pero teníamos una bomba de recirculación del tampón de Bio-Rad (ver http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702929C.pdf) que puede hacer teóricamente hasta 1,5 L/min. No pretende suministrar el tipo de presiones que necesitamos, pero meh - vamos a ver qué pasa...
Así que aquí está lo que nos hiere para arriba con el final:
- Perfusión 3L agua por 15min y luego alta solución salina (sal de cocina 50g en 3L de agua) durante 15 min.
- Perfusión 0.02% tripsina / 0.05% ácido etilendiaminotetracético a 37 ° C durante 1,5 h
- Inundar el agua del grifo durante 10min, luego alta solución salina durante 10 min.
- Perfusión SDS 2% / 1% Tritón X-100 para 50 min.
- Inundar el agua del grifo durante 5 minutos, luego alta solución salina durante 5 min.
- Perfusión de Ácido desoxicólico de 2,5% (25g en 1L) durante 20 min.
- Inundar el agua del grifo durante 5 minutos, luego alta solución salina durante 5 min.
- Perfusión 0,5% OxyClean / etanol 4% durante 1h a 1,7 L/min
- Perfusión de solución salina (25g en 3L), luego agua corriente por 5 min.
- Dejar drenaje, luego cosas en Ikea tarro con Everclear prueba 151!
